– IntermeSNARE

De nombreux processus cellulaires vitaux, tels que la communication neuronale ou la sécrétion d'insuline, reposent sur des événements de fusion extêmement bien régulés entre une vésicules porteuse d'un cargo et la membrane cible. Le centre de la machinerie de la fusion se compose de l'assemblage entre une protéine (v-)SNARE vésiculaire et une protéine (t-)SNARE de la membrane cible. Le complexe formé, appelé SNAREpin, permet de rapprocher les bicouches et d'induire la fusion. l'assemblage des SNARE commence du côté N-terminal et se propage vers l'extrémité C-terminale (modèle du zipper). Ce processus requiert le passage par au moins un état de liaison intermédiaire stable. Beaucoup de questions restent ouvertes. Comment l'assemblage des SNARE est-il contrôlé dans l'espace et le temps? Combien d'énergie est fournie par la formation du complexe SNAREpin? Comment cette énergie est-elle transmise pour obtenir la fusion des membranes? L'assemblage progressif des SNARE complémentaires fournit peut-être suffisamment d'énergie pour atteindre la fusion. Peut-être aussi que les SNARE passent par une série d'états intermédiaires (potentiellement contrôlés par des interactions avec des protéines de régulation), chacun de ces états pourrait apporter suffisamment d'énergie pour faire fusionner les membranes par étapes successives. La caractérisation de ces états requiert de pouvoir (i) mesurer les interactions entre les protéines liées au membranes avec une résolution en distance de l'ordre du nanomètre, et, (ii) de détecter simultanément les changement locaux dans la structure des membranes. Pour cela, nous proposons de combiner un SFA (Surface Force Apparatus) et un dispositif de FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). Le SFA mesure directement les interactions entre deux membranes en fonction de leur distance de séparation et permet d'indentifier les réarrangements moléculaires des espèces interagissant pendant leur association. Le FRET permet une description complète de l'assemblage/désassemblage des acteurs à l'échelle de l'acide aminé, et de mettre en évidence les mélanges lipidiques qui peuvent avoir lieu entre les membranes. Ces techniques seront utilisées sur des membranes portant des SNARE, en présence et en l'absence de différentes protéines de régulation et/ou d'inhibiteurs ou activateurs de la fusion déjà identifiés. Le but est d'obtenir une description complète des intermédiaires lipidiques et protéiques lors de la fusion membranaire. Le système que nous développerons pourra aussi être utilisé sur tout un éventail de protéines membranaires qui subissent des changements conformationels lorsqu'elles jouent leur rôle dans le fonctionnement cellulaire.