Voies de signalisation impliquant l¿intégrine aIIbb3 dans la formation des proplaquettes des mégakaryocytes humains. – MEGAPAK

Nous avons identifié une nouvelle mutation dans le gène de l'intégrine b3 chez un patient atteint de macrothrombocytopénie héréditaire, et montré que l'expression de ce gène muté dans des cellules non-mégakaryocytaires CHO induisait la formation d'extensions cytoplasmiques microtubules-dépendantes semblables aux proplaquettes des mégakaryocytes. Les objectifs de ce projet sont: (a) de comprendre les mécanismes inhérents à la signalisation `outside-in' de cette intégrine mutée en utilisant les cellules CHO transfectées comme système unique et source illimitée de cellules émettant des extensions cytoplasmiques, afin de décortiquer les cascades en aval de aIIbb3; (b) de valider nos résultats sur des mégakaryocytes humains differenciés; (c) d' identifier, en collaboration avec le Centre de Référence des Pathologies Plaquettaires (CRPP), de nouvelles mutations chez des patients ayant des défauts modérés de production de plaquettes ou atteints de thrombopathies héréditaires rares. La mégakaryopoïèse est un mécanisme complexe au cours duquel des cellules souches se différencient au niveau de la moëlle osseuse en mégakaryocytes qui en maturant, forment de longues extensions cytoplasmiques, les proplaquettes qui libèrent à leurs extrémités les plaquettes. Des défauts de production ou de fonctions des plaquettes sont la cause de maladies hémorragiques héréditaires rares, dont l'exploration est coordonnée en France par le CRPP. Les mécanismes qui contrôlent la formation des proplaquettes sont mal connus. Ils requièrent la présence de cytokines, une signalisation par les intégrines et la formation de faisceaux de microtubules qui régulent leur élongation. Ce processus rappelle la croissance des neurites, dont la formation est aussi intégrines et microtubules dépendante, et suggère l'existence de voies de signalisation communes, non tissu-spécifiques, que nous avons pu reproduire dans les cellules CHO par l'expression de l'intégrine aIIbb3 mutée. En prenant appui sur les voies de transduction identifiées dans la croissance des neurites, nous espérons élucider la cascade de signalisation initiée par l'intégrine mutée dans les cellules CHO, puis confirmer nos résultats dans les mégakaryocytes humains cultivés in vitro. Parmi les protéines cibles, nous étudierons la paxilline complexée à Arf-GAP, ainsi que certains membres de la famille des PAK, qui sont des effecteurs des petites GTPases Rac et Cdc42, et impliqués dans la croissance des neurites. Dans les megakaryocytes, la protéine CIB (Ca-and-integrin binding protein) est intéressante, puisqu'elle est un ligand intracellulaire spécifique de l'intégrine aIIbb3, et interagit avec PAK1 en l'activant. La recherche chez les patients explorés par le CRPP de mutations dans les domaines cytoplasmiques des intégrines et de leurs protéines effectrices contribuera a une meilleure connaissance de leur rôle dans les pathologies plaquettaires et des voies requises pour une production de plaquettes normale. Notre approche initiale sera de décripter les cascades de signalisation induites par l'intégrine aIIbb3 mutée dans les cellules CHO, pour comprendre ensuite celles responsables de la formation des proplaquettes des megakaryocytes, par analogie aux processus connus dans la croissance des neurites. Ces résultats devraient ouvrir de nouvelles voies dans la manipulation génétique de mégakaryocytes en culture en vue d'augmenter la production in vitro de plaquettes à des fins transfusionnelles. En collaboration avec le CRPP, nous rechercherons de nouvelles mutations chez des patients ayant des défauts de production de plaquettes ou atteints de thrombopathies héréditaires rares éventuellement associées à une pathologie neuronale. Enfin, l'identification de nouvelles mutations affectant la stabilité des aggregats plaquettaires pourrait permettre de définir de nouvelles cibles pharmacologiques pour les traitements anti-thrombotiques.