Plateforme de production haut débit de Standards Protéiques Marqués isotopiquement (PSAQ) pour la quantification absolue de biomarqueurs en spectrométrie de masse – HT-PSAC

La stratégie originale PSAQ que nous avons développée permet la quantification absolue de protéines en spectrométrie de masse dans des échantillons biologiques complexes. La très vaste majorité des applications biologiques de la spectrométrie de masse requiert un traitement biochimique des échantillons préalablement à l'analyse en spectrométrie de masse. Notre méthode de quantification est basée sur l'incorporation de protéines recombinantes marquées isotopiquement (standards PSAQ) dans les échantillons étudiés dès l'étape de prétraitement biochimique. Une étude comparative entre la méthode PSAQ et les procédés concurrents dits de « quantification absolue » tels qu'AQUA et QconCAT nous a permis de montrer que la méthode PSAQ est beaucoup plus robuste et juste pour la quantification de protéines dans des échantillons biologiques complexes (cf Brun et al, 2007, Mol. Cell. Proteomics 6.12: 2139-2149 et demande de brevet PCT/IB2007/053424 « Method for absolute quantification of polype »). Sa justesse, sa précision, sa très grande spécificité et son caractère multiplexe, font de la méthode PSAQ une alternative très intéressante à l'ELISA pour l'évaluation à grande échelle de biomarqueurs dans les fluides biologiques tels que le sérum.
Nous avons apporté la preuve du concept PSAQ. Dans le cadre du projet HT-PSAQ, nous souhaitons maintenant en renforcer l'assise en vue de la création d'une Spin-Off de LEDyP ou d'un transfert technologique. Pour cela, nous ferons porter notre effort sur 3 points :
1/ Tout d'abord, nous souhaitons augmenter significativement le débit de production des protéines recombinantes marquées isotopiquement (standards PSAQ). En nous inspirant des plateformes développées pour la génomique structurale, nous mettrons en place un prototype de production à haut débit de standards PSAQ. 2/ Par ailleurs, nous développerons des stratégies biochimiques de
« décomplexification » et d'enrichissement qui, associées à la méthode de détection « Multiple Reaction Monitoring » (MRM), nous permettront de repousser la limite de quantification des protéines biomarqueurs. Cette limite, est actuellement comparable à celle de la majorité des ELISA commerciaux (10 pM) après enrichissement spécifique des protéines ciblées. Elle devra être encore accrue d'au moins un ordre de grandeur pour permettre l'évaluation des candidats biomarqueurs plasmatiques les moins concentrés.
3/ Enfin, nous explorerons les approches permettant d'étendre le champ d'application de la méthode PSAQ à la quantification des protéines porteuses de modifications post-traductionnelles.
L'ensemble de ces travaux devrait générer de la propriété intellectuelle et des savoir-faire que nous souhaitons valoriser industriellement après accord de nos supports institutionnels CEA et INSERM.
La méthode PSAQ est la méthode la plus exacte développée à ce jour pour la quantification de protéines en spectrométrie de masse. Mais cette qualité requiert la synthèse in vitro de protéines recombinantes isotopiquement marquées et cette technologie est réputée lourde et nettement plus chère que ses concurrentes. Très peu de laboratoires de spectrométrie de masse ont l'expertise nécessaire pour produire des standards PSAQ. Notre tout premier objectif est d'augmenter nos capacités de production de standards PSAQ marqués isotopiquement pour proposer un service de production haut débit à la communauté scientifique et au secteur privé des biotechnologies. L'augmentation de capacité portera sur le nombre de protéines synthétisables en parallèle et non sur les volumes de production car la quantité de standard PSAQ requise par quantification est de l'ordre du nanogramme. Par ailleurs, la méthode PSAQ peut remplacer avantageusement l'ELISA, dont le développement est long et couteux, pour l'év