– TIPS

1-Contexte scientifique et objectifs du projet : - - Les microtubules (MTs) constituent un élément majeur du cytosquelette de la plupart des cellules eucaryotes où ils participent à des fonctions essentielles, telles que la motilité, le trafic intracellulaire et la division cellulaire. L'ensemble de ces fonctions est rendu possible grâce à leurs propriétés dynamiques qui sont régulées par un grand nombre de protéines, comme les MAPs (Microtubule Associated Proteins). Parmi les MAPs, les +TIPs (plus-end tracking proteins) se fixent spécifiquement aux bouts « plus » des MTs où elles contrôlent leur dynamique et sont impliquées dans leurs interactions avec divers organites cellulaires (kinétochores, vésicules, cortex cellulaire, etc...). Les mécanismes moléculaires sous-jacents restent aujourd'hui largement inconnus. Nous nous proposons de caractériser le rôle de deux +TIPs, CLIP-170 et EB1, dans la régulation de la structure et de la dynamique des MTs, et dans l'ancrage de ceux-ci sur des structures cellulaires telles que les kinétochores. Pour cela, nous envisageons de développer un système acellulaire original fondé sur l'utilisation de billes magnétiques et de composants cellulaires purifiés. - - 2-Description du projet, méthodologie : - - Notre projet comporte deux phases complémentaires qui seront menées en parallèle : (1) effets combinés des +TIPs sur la dynamique et la structure des extrémités des MTs, (2) caractérisation de la capture des MTs par les +TIPs. Le premier point impliquera l'utilisation de la vidéomicroscopie optique par DIC (Differential Interference Contrast) et fluorescence, de la cryomicrosopie électronique, et de méthodes d'analyse d'images. Concernant la capture des MTs, un système acellulaire sera mis au point à partir de tubuline et de centrosomes purifiés, auxquels seront ajoutées des billes magnétiques recouvertes spécifiquement de +TIPs. L'utilisation d'un champ magnétique permettra d'aligner les billes en réseaux parallèles. Les MTs, nucléés à partir des centrosomes, viendront interagir avec les billes alignées. Les contacts entre MTs et +TIPs (fixées aux billes), ainsi que les propriétés dynamiques des MTs et leurs déformations éventuelles, seront analysés par vidéomicroscopie optique. Des méthodes de modélisation théorique permettront d'intégrer l'ensemble de ces paramètres. Par la suite, un système plus physiologique sera développé en fixant sur les billes des kinétochores, « normaux » ou déplétés en +TIPs, assemblés in vitro à partir d'un extrait cellulaire et de noyaux purifiés. Ce projet impliquera une étroite collaboration avec un physicien de l'Université de Rennes 1, Zoher Gueroui (CR2 CNRS), qui s'intéresse aussi au cytosquelette microtubulaire. La contribution de ce physicien sera particulièrement utile lors de la mise au point du système acellulaire et des outils d'analyse. - - 3-Résultats attendus : - - Notre approche nous permettra de caractériser en détail les propriétés intrinsèques de deux +TIPs, CLIP-170 et EB1, dans un système simple reconstitué. La fonction de capture de ces protéines pourra ainsi être quantifiée précisément et sera directement corrélée aux propriétés physiques et dynamiques des MTs. Nous analyserons dans ce système l'activité individuelle et combinée de CLIP-170 et EB1 ainsi que leur régulation éventuelle par d'autres partenaires. L'utilisation d'un système plus physiologique nous permettra d'identifier précisément le rôle de ces protéines dans l'interaction des MTs avec les kinétochores. Ces résultats obtenus en système acellulaire seront complétés par une analyse classique structurale et dynamique des extrémités des MTs en présence de CLIP-170 et/ou EB1. Ceci nous conduira à une meilleure compréhension, à l'échelle moléculaire, des mécanismes d'interaction entre les MTs et leurs cibles cellulaires. - ...