– AFM-Assembly

1- Contexte scientifique et objectifs du projet : La post-génomique a accéléré la détermination de la structure des protéines d'une grande quantité d'organismes. Plus de 86 000 domaines structuraux de protéines sont aujourd'hui connus. L'enjeu pour la biologie consiste désormais à comprendre comment ces domaines s'assemblent pour former les grands complexes protéiques multi-domaines. Les méthodes biophysiques actuelles rencontrent des difficultés croissantes, comme celle d'obtenir la cristallisation de complexes de taille importante, dans l'étude des protéines multi domaines et des assemblages à leurs partenaires. Les avancées récentes de la microscopie à force atomique (AFM) nous incitent à penser que cette technique est particulièrement bien adaptée pour relever les défis de la biologie structurale, surtout à cause de la facilité de préparation des échantillons biologiques. Les images en AFM ne sont pas obtenues via un système de lentilles, mais par des pointes très fines qui permettent d'explorer les propriétés de la surface de l'échantillon. Les échantillons n'ont pas besoin d'être sous forme cristalline, ni orientés, et la technique convient pour étudier de très petites quantités de matériel biologique au niveau de la molécule unique. L'objectif de ce programme est de démontrer que la représentation de la surface des protéines, appelée enveloppe topographique, nous permettra de reconstruire la structure de grandes protéines multi domaines aussi bien que des complexes protéine – protéine. 2- Description du projet, méthodologie : Le projet se compose de deux parties complémentaires : la collection d'enveloppes topographiques à haute résolution de protéines en utilisant l'AFM puis la reconstruction in silico de ces macromolécules à partir de composants isolés pour lesquels nous disposons des coordonnées tridimensionnelles. Pour cela, notre projet repose sur le développement de techniques de modélisation moléculaire in silico intègrant comme contraintes expérimentales les enveloppes topographiques obtenues par l'AFM. Dans cette demande nous proposons de démontrer la faisabilité de cette approche sur trois systèmes différents mais complémentaires : une grosse protéine multi domaines (un anticorps) qui sera reconstruite en utilisant ses fragments isolés (Fab et Fc) ; puis un complexe protéine - protéine constitué par deux facteurs de coagulations, le facteur Va et son enzyme associée le facteur Xa ; enfin l'assemblage de la structure quaternaire d'une protéine de structure inconnue en utilisant un modèle moléculaire que nous avons récemment construit. Le premier défi sera de générer des images de haute résolution de macromolécules isolées. Nous nous appuierons sur les plus récentes techniques de traitement d'image, comme les algorithmes de déconvolution de pointe, et pour améliorer la résolution latérale des enveloppes topographiques nous utiliserons des pointes hyperfines munies de nano tubes de carbones. Le second défi concerne la maîtrise des algorithmes de reconstruction pour l'assemblage des molécules dans l'espace réel. La stratégie que nous développerons consiste à transformer des enveloppes topographiques obtenues par AFM en volumes moléculaires. Ces volumes seront ensuite utilisés comme espaces finis, dans lesquels une recherche exhaustive, par un processus appelé auto accostage, de la meilleure orientation dans les six dimensions des domaines isolés sera recherchée. Notre laboratoire est certifié ISO9001:2000. Le management du projet suivra les règles de cette norme. Ainsi, le planning de notre projet qui s'étale sur trois années sera marqué par des jalons clairement identifiables. 3- Résultats attendus : Le but de ce projet de trois années est la construction d'un protocole complet d'analyse qui utilise comme données d'entrée les enveloppes de haute résolution obtenues par AFM ainsi que les coordonnées atomiques d'une molécule et fournit une prédiction d'orientation de cette molécule dans le volume défini par les enveloppes. Les applications de ces reconstructions de protéines multi domaines concernent l'étude de la flexibilité conformationnelle des grandes macromolécules, une propriété essentielle des anticorps, par exemple. De plus elles permettront la caractérisation de grandes macromolécules contenant des régions ou domaines partiellement non repliés, propriété qu'il est extrêmement difficile d'étudier par les méthodes classiques de la biologie structurale. Enfin, l'utilisation de contraintes expérimentales lors d'accostage protéine-protéine ouvre une nouvelle voie dans la construction de super-complexes au niveau atomique.