Dynamique et fonction des contacts adhésifs neurexine/neuroligine comme éléments déclencheurs de la synaptogénèse – Neuroligation

La synaptogénèse est un processus complexe qui se met en place aux sites de contacts inter-neuronaux, initié par des molécules d'adhésion spécifiques. Des études fondées sur des systèmes de neurones en culture, ont montré que l'interaction adhésive entre la neurexine pré-synaptique et la neuroligine post-synaptique joue un rôle important dans l'assemblage synaptique. Malgré ces progrès récents, il reste un bon nombre de questions en suspens, notamment 1) la cinétique de recrutement des composants moléculaires et les mécanismes sous-jacents qui mènent du contact adhésif initial à une synapse fonctionnelle, 2) la spécificité et la physiologie des divers composants recrutés; et 3) l'implication des neuroligines dans la mise en place de réseaux neuronaux fonctionnels. Notre projet veut identifier les interactions moléculaires et la séquence précise d'événements qui gouverne la formation de synapses excitatrices en réponse à l'interaction adhésive initiale neurexine/neuroligine.//Notre projet s'articule autour de 4 axes
Nous utiliserons les pinces optiques pour initier des contacts entre des microsphères recouvertes de neurexine et des cultures de neurones primaires, et initier ainsi une différentiation post-synaptique. Dans des neurones transfectés avec des protéines étiquetées GFP, nous mesurerons les vitesses de recrutement de la neuroligine, de protéines d'échafaudage et des récepteurs du glutamate AMPA et NMDA au niveau de ces contacts initiaux. Cela nous permettra d'estimer avec une excellente résolution temporelle la cinétique de mise en place de ces complexes moléculaires dans des synapses en formation.
A l'aide de techniques d'imagerie dynamique de fluorescence (suivi de molécules individuelles, FRET, FLIM, FRAP), nous allons déterminer les mécanismes moléculaires qui induisent le recrutement de la PSD-95 par la neuroligine, et les cinétiques de cette liaison. Nous évaluerons le rôle de la liaison du ligand neurexine, et essaierons de perturber l'interaction PSD-95/neuroligine avec des peptides compétiteurs et protéines mutées. Ces expériences permettront d'identifier le rôle de cette interaction moléculaire dans la stabilisation du compartiment post-synaptique.
Nous allons mesurer la composante fonctionnelle des contacts neurexine/neuroligine en utilisant des techniques d'électrophysiologie et d'imagerie de fluorescence (décageage de glutamate et mesure des entrées calciques). Nous examinerons en particulier la présence respective des récepteurs du glutamate AMPA et NMDA au niveau de post-synapses initiées par la liaison neurexine/neuroligine.
Nous allons développer un système biomimétique de la synaptogénèse en cultivant des neurones sur des substrats formés de réseaux réguliers d'îlots recouverts de neurexine purifiée. Cette technique devrait induire une différentiation synaptique à de multiples endroits parfaitement localisés, et servir ainsi de système pour un criblage haut débit de composés pharmacologiques.//A partir de la mesure des interactions dynamiques entre des molécules clés de la densité post-synaptique, nous espérons identifier la chronologie précise des événements qui mènent de la reconnaissance adhésive initiale neurexine/neuroligine à l'assemblage d'une post-synapse fonctionnelle. En utilisant à la fois des systèmes biomimétiques pour déclencher l'adhésion neurexine/neuroligine, et des expériences sur des cultures cellulaires dans des conditions de perturbation de ces interactions moléculaires, nous pensons révéler comment l'organisation dynamique de ces complexes macromoléculaires détermine la spécificité et la fonction synaptique. Enfin, nous proposons un système permettant un criblage de composés pharmacologiques susceptibles de modifier la synaptogénèse. Ceci pourrait déboucher sur l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques pour traiter des maladies du cerveau associées à des mutations génétiques de la neuroligine (autisme et retard mental).