Détection de la protéine pathologique du prion, PrPSc, dans les liquides biologiques par des dérivés thiényl pyrimidiques et thiényl azines. – PrP détection

La sécurité sanitaire des produits sanguins, soient 90 millions de dons de sang au niveau mondial, fait l'objet de nombreuses inquiétudes quant au risque de contamination de l'homme par des prions. Actuellement, il n'existe pas de test pour détecter des prions dans le sang humain, ni test de diagnostic précoce de la maladie de Creutzfeldt-Jakob. Trois données vont dans le sens de la prise en compte d'un principe de précaution :
1. En 2004, une étude britannique estime que 3800 personnes pourraient être contaminées par des prions sans le savoir.
2. Une surveillance européenne accrue a montré une recrudescence des formes sporadiques de CJD chez l'homme.
3. Trois patients anglais ont développé la nouvelle variante de la maladie de Creutzfeldt-Jacob (vCJD), à la suite d'une transfusion de sang contaminé par des prions infectieux.
Certains produits biologiques comme les cellules souches nécessitent l'utilisation de sérum bovin pour lesquels aucun test vis-à-vis du prion n'est réalisé.
Nous avons identifié par criblage virtuel suivi d'un criblage in vitro sur des cultures de cellules infectées par les prions, plusieurs dérivés thiényl pyrimidiques ou thiényl azines, appelés P30, A6 et Bis-A6, qui augmentent remarquablement et spécifiquement l'oligomérisation de l'isoforme pathologique de la protéine du prion, PrPSc. Nous avons montré d'une part, que ces produits n'augmentent pas l'oligomérisation de la forme normale du prion PrPc, et d'autre part, que des lysats cellulaires, incubés pendant 1h en présence des produits P30, A6 ou BisA6 provoquent l'oligomérisation de la PrPSc. L'amplification de l'oligomérisation dans les extraits cellulaires est supérieure d'un facteur 100 à la concentration de 1 uM.
Au vu de la spécificité de ces produits pour l'isoforme pathologique PrPSc, notre objectif est de développer un test de diagnostic précoce des maladies à prions en amplifiant le taux de PrPSc dans des extraits de tissus homogénéisés ou des liquides biologiques. Pour développer ce test de diagnostic précoce, le mécanisme d'action qui conduit à l'oligomérisation de la PrPSc doit être identifié. Notre hypothèse est que ces produits interagissent directement avec les molécules PrPSc et provoquent leur dimérisation. Afin de réaliser nos objectifs, l'interaction entre les produits P30, A6 et BisA6, et les prions issus de différents extraits infectieux (souches de prions d'espèces variées, tissu et sang) sera analysée par immunoblot. Nous utiliserons également la technique de résonance plasmonique de surface (BiaCoreTM) pour caractériser les constantes d'association entre les isoformes, PrPC , PrPSc et les dérivés P30, A6 et BisA6. En parallèle, notre partenaire effectuera des synthèses chimiques afin d'identifier les groupements essentiels à l'activité d'oligomérisation. Les molécules les plus actives seront greffées afin de permettre leur ancrage sur support, type plaque de microtitration ou puces BiaCoreTM, afin de développer un prototype de dosage.
Trois résultats sont attendus :
- Générer une activité oligomérique sur des extraits de tissus infectés par des souches de prions différentes avec les dérivés P30, A6 et BisA6.
- Montrer une interaction directe entre les produits P30, A6 ou BisA6 et l'isoforme infectieuse PrPSc, par des techniques biochimiques (BiaCoreTM) et biophysiques (anisotropie de Fluorescence, FCS) afin de mieux comprendre le mécanisme de liaison entre les différentes molécules. De plus, la fluorescence intrinsèque de ces dérivés est un atout important. En effet, elle permet d'envisager le développement d'un test diagnostic très simple et peu coûteux, sur plaque de microtitration avec détection de l'interaction par fluorescence.
- Modifier les dérivés les plus actifs par synthèse chimique (partenaire 2), afin de prévoir leur ancrage sur des supports solides comme des plaques de microtitration ou des sensor