Dosage des microparticules plasmatiques pro-coagulantes au moyen de particules d¿or fonctionnalisées par l¿Annexine-5 – MP NP AuA5

La présence dans le plasma sanguin de microparticules (MP) membranaires, issues de l'apoptose ou de cellules activées, suscite beaucoup d'intérêt en raison de leurs diverses fonctions physio-pathologiques, principalement en raison de leur rôle de marqueur de l'état pro-thrombotique. Les propriétés pro-coagulantes des MP sont dues à la présence à leur surface de phosphatidylsérine (PS), phospholipide anionique essentiel au processus de la coagulation sanguine. La corrélation entre taux élevé de MP et risque thrombotique explique les efforts de développement de tests de quantification des MP. La majorité des tests proposés sont basés sur l'utilisation de l'Annexine-5 (Anx5) comme marqueur des MP, en raison de la spécificité et de l'affinité de liaison de l'Anx5 à des membranes exposant de la PS (membranes-PS) en présence de Ca2+. Le clinicien ne dispose pas de test diagnostic simple et fiable permettant le dosage des MP, hormis un test à l'essai depuis 2007.
Ce projet concerne le développement d'un test diagnostic de quantification absolue des MP plasmatiques pro-coagulantes, présentes dans des échantillons de plasmas pauvres en plaquettes (PPP), à l'aide de nanoparticules (NP) d'or (Au) fonctionnalisées par l'Anx5 (NP-Au-Anx5). La haute sensibilité du test (objectif : 10 pM en équivalent PS, soit au moins 10x plus sensible que les tests de fluorescence) repose sur les propriétés optiques des particules d'or. La quantification absolue des MP sera basée sur la détermination de leur surface pro-coagulante et utilisera les propriétés de liaison saturante et quantitative de l'Anx5 à des membranes-PS. L'approche expérimentale consiste à titrer la surface des MP au moyen de NP-Au-Anx5 par quantification des NP-Au-Anx5 non liées aux MP, par mesure d'absorbance, après séparation des NP-Au-Anx5 libres et liées par filtration sur membrane poreuse. La quantité absolue des MP est exprimée en nM équivalent PS, par référence à une valeur absolue établie avec le système modèle des liposomes.
Les points forts de ce projet sont les suivants :
- Notre équipe a une longue expérience de l'Anx5 et des complexes entre Anx5 et membranes.
- Ce projet repose sur l'utilisation de NP-Au-Anx5 comme marqueur des MP. Les NP-Au-Anx5 ont été développées selon une méthode de synthèse originale (brevet déposé en 2006), à partir de protéines dérivées de l'Anx5 ayant fait l'objet d'un brevet publié en 2006.
- De grandes quantités de NP-Au-Anx5 sont disponibles, de rapport Anx5 / NP-Au contrôlé, stables à haute concentration (> 1017 Particules / L) dans des tampons physiologiques, avantages majeurs par rapport aux solutions de NP-Au commerciales.
- L'Anx5 liée aux NP-Au conserve ses propriétés de liaison spécifique et quantitative aux membranes-PS.
- Les principales étapes de ce projet ont été validées au niveau de liposomes, de corps apoptotiques exposant de la PS ou de MP.
La mise au point d'un test diagnostic mesurant la quantité absolue des MP pro-coagulantes permettra de mieux évaluer l'état pro-thrombotique des patients, ce qui permettra une adaptation plus précise des traitements préventifs et curatifs anti-coagulants. L'absence actuelle de tests de mesure des MP résulte des difficultés de standardisation des méthodes de préparation et d'analyse des échantillons sanguins. L'avantage principal de ce test par rapport aux tests proposés précédemment est de mesurer, de manière simple, la quantité totale des MP. Le marché potentiel d'un test de dosage des MP pro-coagulantes est très important ; il recouvre en amont le marché de la thrombose. La connaissance du taux des MP permettra en particulier d'optimiser les nouveaux traitements, coûteux, de pathologies thrombotiques, comme le fondaparinux, l'orgaron, ou les protéines recombinantes, comme le NovoSeven ou le Xigris.