Amélioration de la production de protéines recombinantes dans les cellules eucaryotes – CYTOBOOST

RESUME PROJET – Contexte scientifique et objectifs L'expression d'une protéine eucaryote, produit d'un gène, dépend de la transcription, la maturation, la stabilité et la traduction des ARNm ainsi que de la stabilité de la protéine. A ce jour l'optimisation de la production de protéines recombinantes en cellules eucaryotes dans l'industrie, un enjeu majeur, ou pour la recherche a été faite par des améliorations dans la transcription ou la maturation des ARNm. L'amélioration de la traduction a été peu étudiée. L'efficacité de la traduction d'un ARNm peut être régulée par des facteurs stimulateurs ou inhibiteurs liés à des séquences spécifiques situées dans les régions non-codantes et donc indépendante de la séquence codant la protéine d'intérêt. La synthèse protéique nécessite le recrutement des ribosomes sur l'ARNm qui se fait en général via un complexe se formant au niveau de la coiffe située en 5' de l'ARNm. Donc, tout événement qui favorise la formation du complexe au niveau de la coiffe augmentera la synthèse protéique.RESUME PROJET – Description Notre but est de développer un procédé qui augmente la production de protéines recombinantes dans les cellules eucaryotes. Nous appelons Cytomodulines des protéines hybrides composées d'un domaine régulateur et d'un domaine de liaison à l'ARN. Différents domaines régulateur et de liaison à l'ARN peuvent être utilisés, permettant de varier l'effet induit ou l'ARN ciblé. Dans le projet Cytoboost, le domaine régulateur devrait augmenter la traduction en stabilisant le complexe d'initiation au niveau de la coiffe. Deux contraintes sont imposées aux Cytomodulines positives : 1) ne pas se lier aux ARNm endogènes et 2) remplacer fonctionnellement un facteur de traduction endogène. Ainsi, aucun des deux domaines peut être dérivé d'une protéine eucaryote. Par contre, les protéines bactériennes ou d'origine virale sont des candidates de choix. Nous avons développé un prototype de Cytomoduline positive composée de la protéine de liaison à l'ARN de bacteriophage, MS2-CP, et d'une protéine de rotavirus, NSP3, qui se lie à la protéine eIF4G, un composant structurant du complexe de coiffe. Ce prototype peut stimulé jusqu'à 4 fois la traduction d'un ARNm rapporteur dans les cellules en culture (US provisionnel enregistré en juillet 2006). Dans ce projet nous allons 1) générer de nouvelles Cytomodulines positives qui auront une capacité accrue à stimuler la traduction d'un ARNm recombinant, 2) définir tous les paramètres moléculaires pour l'utilisation du procédé Cytoboost et 3) valider quantitativement le procédé Cytoboost dans les conditions similaires à celles utilisées dans l'industrie. Cette validation sera faite pour les protéines sécrétées ou non et dans les cellules CHO et BHK transfectées de manière transitoires ou exprimant de manière stable les Cytomodulines et/ou les ARNm cibles. Finalement, nous caractériserons d'éventuels effets secondaires des Cytomodulines par l'analyse des changements de l'expression des gènes (transcriptome).RESUME PROJET – Resultats attendus Le procédé Cytoboost s'ajoute aux protocoles de production existants. Deux entreprises ont manifesté leur intérêt pour ce procédé mais demandent des validations complémentaires, programmées dans ce projet. La Cytomoduline positive améliorée contiendra la portion minimale de NSP3 nécessaire à l'effet de stimulation et la partie MS2-CP dans la meilleure géométrie. Les analyses du transcriptôme assureront que ces Cytomodulines n'affectent que la traduction de l'ARNm recombinant cible. Ce programme fournira des données solides pour élargir le brevet US provisionnel actuel. L'étendue des conditions utilisées pour les validations quantitatives renforcera nos réclamations de brevet. Les intérêts déjà exprimés par deux compagnies sont des bons indicateurs d'un usage (licence) rapide du procédé Cytoboost. Selon les demandes futures des compagnies privées d'autres développements seront entrepris pour lesquels un modèle économique sera