– APPSERPROT

1-Contexte scientifique et objectifs du projet La surproduction du peptide beta- amyloïde (Abeta), en conduisant aux plaques séniles contribue vraisemblablement à l'étiologie de la maladie d'Alzheimer. Une approche thérapeutique visant à ralentir ou bloquer l'apparition de ces plaques consisterait donc à cibler les enzymes responsables de la formation de Abeta à partir de la betaAPP (beta-Amyloid Precursor Protein). Celle-ci fait intervenir de façon séquentielle deux aspartyl-protéases, les beta- et gamma-sécrétases. La beta-sécrétase a été identifiée, mais la gamma-sécrétase qui catalyse une coupure transmembranaire, implique vraisemblablement deux systèmes protéolytiques de nature encore incertaine. Le majeur, dépendant des présénilines (PS), est un complexe d'au moins 4 protéines dont une préséniline, qui clive aussi d'autres protéines vitales dont Notch. Bloquer cette activité pour inhiber Abeta s'avérerait délétère pour la fonction de Notch. Différentes études ont cependant montré qu'il était possible d'inhiber sélectivement la coupure gamma de la betaAPP, selon des mécanismes non identifiés. Ainsi, le Partenaire 1 a récemment établi que des isocoumarines (nommées JLK) inhibiteurs suicide de protéases à sérine étaient capables d'inhiber la production d'Abeta par des cellules exprimant la betaAPP, sans affecter la voie Notch (Nat. Cell Biol. 3, 507, 2001). Une autre étude a montré que des peptide-boronates, inhibiteurs réversibles de protéases à sérine, présentaient une activité similaire sur la betaAPP, mais l'activité sur Notch n'a pas été établie. Ces études suggèrent qu'une protéase à sérine, inconnue, serait impliquée dans la régulation de la coupure gamma de la betaAPP et ceci de façon indépendante des PS. Nos objectifs sont de répondre à plusieurs questions fondamentales. Quelle est la protéase à sérine ciblée par ces composés ? Réalise-t-elle une coupure beta ou agit-elle en amont des gamma-sécrétases ? Si elle agit en amont, quel est le lien entre ces deux activités protéolytiques ? Enfin, cette protéase est-elle une cible thérapeutique potentielle ? 2-Description du projet, méthodologie Un important programme de chimie consistera d'abord à rechercher des inhibiteurs plus puissants que les JLK (IC50 = 80 ?M). Différentes séries de composés seront explorées. Nous réaliserons la synthèse d'analogues des JLK et aussi d'autres structures isocoumarines, dont l'avantage est de former des complexes covalents avec leur cible. Des voies de synthèse originales en solution et/ou sur support solide ont été développées, qui permettront d'aborder une approche de type combinatoire. Nous nous intéresserons également à d'autres inhibiteurs suicide de protéases à sérine (benzoxazinones, isobenzofuranones,...) pour élargir la recherche de structures plus intéressantes. Enfin, certains peptide-boronates seront préparés pour établir si leur cible peut être la même que celle des JLK. La capacité des composés synthétisés à inhiber la production d'Abeta sera mesurée in vitro sur diverses lignées cellulaires exprimant la betaAPP et sur des membranes. Leur innocuité sur la fonction de Notch sera examinée. Les composés les plus intéressants seront choisis pour préparer des sondes biotinylées ou fluorescentes pour caractériser leur(s) cible(s). Ainsi, des extraits protéiques de cellules traitées avec les inhibiteurs biotinylés seront séparés par chromatographie d'affinité sur colonne d'avidine monomérique. Les éventuelles protéines biotinylées seront éluées par un excès de biotine (KD = 10-8 M) et caractérisées par spectrométrie de masse après séparation électrophorétique. Les extraits protéiques pourront être aussi séparés sur gel 2D, suivi d'un transfert sur membrane où les éventuelles protéines biotinylées pourront être repérées par l'avidine tétramérique (KD = 10-15 M) couplée à une enzyme, puis identifiées par séquençage. La localisation cellulaire de protéine(s) éventuellement marquée(s) par un inhibiteur fluorescent pourra êt