Etude des facteurs de remodelage de la chromatine. – FaRC

1-Contexte scientifique et objectifs du projet : L'ADN de nos cellules est compacté au sein du noyau sous forme de chromatine, une structure nucléo-protéique formée par la répétition d'une unité fondamentale, le nucléosome, résultant de l'enroulement de l'ADN autour d'un octamère d'histones. La chromatine peut être organisée localement en une fibre hélicoïdale compacte de 30 nm de diamètre, la densité de cette structure limitant à grande échelle, l'expression de gènes contigus. Cette compaction de la chromatine peut être régulée de diverses manières, en particulier par l'action de facteurs de remodelage de la chromatine (FaRC en Français, CRF en Anglais) ATP-dépendants. Ces facteurs modifient la structure chromatinienne en altérant apparemment la disposition des histones le long de l'ADN. En effet, des études en volume ont montré qu'en présence de FaRC, la position d'une histone sur un fragment d'ADN était modifiée, celle-ci étant déplacée du centre vers l'extrémité (ou vice versa). Il n'est cependant pas clair que ce déplacement soit lié à un mouvement de l'histone poussée par un FaRC ou plutot à un déplacement de l'ADN. Le groupe de l'ENS, en collaboration avec T.Owen-Hughes (Ecosse), a étudié l'activité de FaRC sur de l'ADN nu (sans histones). Le groupe écossais ayant observé que les FaRC extrudaient des cruciformes sur de l'ADN nu, nous avons montré que cette activité résultait de la formation d'une boucle d'ADN, dont nous avons caractérisé la taille, le temps de formation ainsi que la dépendance de ces deux paramètres avec la force et la concentration en ATP. Sur la base de ces observations, nous avons formulé un modèle qui nous guidera dans nos études de l'interaction des FaRC avec la chromatine. Parallèlement, les groupes de Curie et de l'ENS ont étudié conjointement la dynamique d'assemblage et les propriétés mécaniques d'une fibre de chromatine. L'équipe de l'IGR étudie par AFM/SEM depuis de nombreuses années les propriétés structurales de l'ADN et les mécanismes de reconnaissance de sites cibles par des protéines. Ces études serviront de base pour l'interprétation des observations sur l'interaction FaRC/chromatine. 2-Description du projet, méthodologie : Le projet proposé unit les expertises de nos quatre groupes afin d'étudier les interactions FaRC/chromatine. Dans un premier temps, nous étudierons par AFM/SEM l'interaction entre un nucléosome et un FaRC. Nous chercherons à savoir s'il y a formation d'une boucle d'ADN et déplacement du nucléosome. En parallèle, nous étudierons par microscopie TIR sur des ADN étirés, le déplacement ATP-dépendant d'histones fluorescentes (taguées GFP) par des FaRC. Nous caractériserons la vitesse et la distance parcourue en fonction de la concentration en ATP. Finalement nous étudierons, à l'aide de pinces magnétiques, la dynamique d'interaction entre nucléosomes et FaRC : y a-t-il formation d'une boucle, à quelle vitesse, quel est le degré de surenroulement de l'ADN dans celle-ci, quel est son temps de vie, etc ? Comment ces observables varient-elles avec la tension dans l'ADN, avec la concentration en ATP ? Nous comparerons ces résultats à ceux déjà observés sur ADN nu. Des variants d'histones et des histones portant des modifications chimiques seront utilisés lors des reconstitutions de nucléosomes ou de chromatine afin de déterminer l'impact qu'ont ces paramètres sur l'efficacité du fonctionnement des FaRC par rapport à des nucléosomes « classiques » et sans modifications. 3-Résultats attendus : Les résultats attendus devraient nous permettre de mieux comprendre la dynamique et le mécanisme du remodelage de la chromatine, pour ainsi répondre à un certain nombre de questions : est-ce l'ADN qui bouge ou les histones qui sont déplacés par les FaRC ? quelle est l'influence des variants d'histones ou des histones modifiées chimiquement sur l'activité des FaRC ? Nous espérons quantifier la vitesse de déplacement, la processivité, le pas, le degré d'enroulement induit dans l'ADN su..