Exploration fonctionnelle des mutations de SHP2 responsables des syndromes de Noonan et LEOPARD - Consequences pour la résistance à l'hormone de croissance – SHP2NOONAN

Les syndromes de Noonan (SN) et LEOPARD (SL) sont des désordres hétérogènes caractérisés par une petite taille, des troubles cardiaques et un risque tumoral élevé. Ils sont causés par des mutations de Shp2, une tyrosine phosphatase avec des domaines de haute affinité (SH2) pour les phosphotyrosines. Les conséquences cellulaires de ces mutations sont inconnues alors qu'elles permettraient de comprendre leurs multiples manifestations cliniques. Nous avons récemment développé des outils moléculaires pour déchiffrer la fonction de Shp2 comme relais de signalisation pour les récepteurs de facteur de croissance. Nous avons montré que Shp2 controle l'activation des voies Ras/MAPK et PI3K/Akt en régulant la phosphorylation de Gab1, adaptateur phosphorylé par les récepteurs transmembranaires, sur ses sites de liaison à RasGAP et PI3K, respectivement. Nous proposons d'utiliser cette expertise et nos outils moléculaires à l'exploration des conséquences des mutations de Shp2.*******************Les buts de ce projet sont 1) d'améliorer la connaissance des mutations SN/SL sur l'activité catalytique de Shp2, notre dernière étude suggèrant qu'elles modifient la spécificité de substrat de Shp2. 2) d'identifier les voies de signalisation en aval de Shp2 déficientes dans les SN/SL, les meilleures candidates étant les voies Ras/MAPK et PI3K/Akt. 3) déterminer le role des mutants de Shp2 dans la résistance à l'hormone de croissance observée dans le SN. Pour atteindre ces objectifs, les mutants de Shp2 seront produits comme protéines recombinantes pour doser leur activité sur des substrats validés de Shp2. Nous utiliserons aussi des vecteurs pour transfection cellulaire et pour expression adénovirale. Nous avons caractérisé des lignées cellulaires où l'activation de Ras/MAPK et PI3K/Akt nécessite Shp2 pour déphosphoryler Gab1 sur ses sites de liaison à RasGAP et PI3K, respectivement. L'analyse de ces voies et de la liaison de Gab1 à ses partenaires nous donne la possibilité unique de suivre l'activité des mutants de Shp2 in situ. Ceci nécessite les techniques suivantes couramment pratiquées au laboratoire: mesure HPLC des produits lipidiques de PI3K; dosage in vitro d'activité lipide kinase; mesure d'activation de MAPK et Akt par test kinase ou phosphorylation, de Ras par précipitation d'affinité; mesure de liaison de Gab1 à ses partenaires par protéines de fusion GST-PI3K, -Shp2 et -RasGAP. Nous disposons de dominants négatifs ou positifs pour Gab1, PI3K, Shp2, RasGAP. Suivant des procédures courantes du CHU, nous obtiendrons et immortaliserons des fibroblastes de peau de patients qui seront une ressource précieuse pour valider nos hypothèses puis ouvrir plus largement l'étude de ces pathologies. De nouveaux outils seront développés, tels que anticorps phosphospécifiques reconnaissant les substrats de Shp2 (p.ex. sites de liaison de Gab1 à PI3K et RasGAP) qui pourront ensuite être utilisés à des fins diagnostiques.*******************Nous montrerons: 1) qu'il est essentiel de considérer l'influence des mutations de Shp2 sur sa spécificité de substrat et que les patients SL présentent une hyperstimulation de la voie PI3K/Akt. Cette voie bloquant l'apoptose, ceci expliquerait pourquoi Shp2 mutée augmente le risque de cancer; 2) que les kinases Src, des relais cytosoliques essentiels pour facteurs de croisance et hormones, sont anormalement activés dans SN/SL, ce qui expliquerait des anomalies de différentiation cellulaire impliquées dans SN/SL; 3) que l'insensibilité à l'hormone de croissance (GH) des patients SN est provoquée par une hyperactivité de Shp2 sur les sites d'interaction Gab1/PI3K, provoquant une hypoactivation d'Akt et un déficit de production d'IGF-1. Cette étude posera les bases moléculaires pour comprendre l'hétérogénéité de SN/SL. Son but est la mise en place de tests simples pour définir pour chaque patient les conséquences de sa mutation sur la signalisation en relation avec ses propres symptomes.