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Edition 2014


EZOtrad


Exploration des Zones d’Ombre de la Traduction

Exploration des Zones d’Ombre de la Traduction (EZOtrad)
Les facteurs essentiels nécessaire pour la traduction des ARNm par le ribosome sont identifiés depuis le début des années 1970. Cependant les essais de traduction in vitro actuels produisent infiniment moins de protéines que lors d’une production in vivo. Cette observation implique que des facteurs et/ou des mécanismes importants de la traduction nous échappent encore. Pour répondre à ce problème nous cherchons à identifier et caractériser de nouveaux facteurs de traduction.

Augmenter la connaissance des mécanismes de traduction des ARNm et de leur couplage avec les autres mécanismes du dogme central de la biologie.
Une première tâche consiste à étendre et approfondir l’étude des facteurs de traduction de la famille ABC-F que mes collaborateurs et moi-même avons caractérisés. Nous avons montré que la protéine EttA, appartenant à la famille ABC-F, module la dynamique du ribosome afin de réguler l’activité de synthèse des protéines en fonction du niveau d’énergie cellulaire. Nous étudions maintenant plus en détail la réponse physiologique régulée par le gène ettA. Parallèlement, nous étendons notre étude aux 3 paralogues d’EttA présents chez E. coli, ainsi que des orthologues responsables de résistances aux antibiotiques chez des bactéries pathogènes.

La deuxième tâche du programme est le développement d’une méthode de criblage permettant d’identifier des phénotypes spécifiques de défaut de la traduction dans une collection de mutants. Cette collection sera composée de mutants de délétion de gènes dont le produit est connu pour interagir avec le ribosome mais dont la fonction reste élusive. La méthode de criblage est basée sur des éléments de l’ARNm qui freinent la synthèse de protéines que nous avons identifiée au début de cette étude (Boël et al., Nature jan 2016). Conjointement à ce crible, nous mettrons en place une approche par « pull-down » afin d’identifier de nouveaux facteurs qui fixent le ribosome lorsqu’il cale sur des éléments de l’ARNm qui ralentissent sa progression.

Approche expérimental
Pour caractériser les ortologues de la protéine EttA nous appliquons la même approche expérimentale qui nous a permis de découvrir la fonction de la protéine EttA (Boël et al, NSMB 2014 ; Chen et al., NSMB 2014). Pour les paralogues impliqués dans la résistance aux antibiotiques (macrolides) nous avons identifié une protéine ABC-F de streptococcus qui exprimée chez E. coli induit la résistance. Cette approche hétérologue nous permet de pouvoir utiliser tous les outils et protocoles développé chez E. coli pour étudier le mécanisme d’action de la résistance aux macrolides d’une protéines ABC-F issue d’une bactérie pathogène.

Afin d’approfondir l’étude de la traduction des ARNm, nous avons utilisé un large jeu de données d’expression de protéine chez E. coli pour identifier les éléments (structures, codons composition en nucléotides) de l’ARNm qui influent sur sa traduction (Boël et al., Nature 2016). L’identification de ces éléments nous permet maintenant de construire une librairie de gènes rapporteurs qui nous servira de boite à outils pour étudier la traduction. Ces rapporteurs permettront de suivre in vivo l’expression de séquences contenant des éléments qui ralentissent la traduction, cela afin de : (i) confirmer et étudier leurs effets sur le mécanisme de traduction, (ii) identifier de nouveaux facteurs de traduction qui modulent leurs influences, (iii) purifier des complexes de ribosomes calés sur ses éléments pour en identifier la composition.

Résultats

Pour la première tâche du projet, nous avons identifié les métabolites du milieu de culture qui influence le phénotype de mutant de délétion du gène ettA et ainsi commencé la caractérisation de la réponse physiologique régulée par ettA. Nous avons aussi caractérisé certains des domaines d’EttA nécessaires pour sa fonction. Enfin nous avons montré que d’autres ABC-F sont aussi impliqués dans la régulation de la traduction des ARNm.

En ce qui concerne la deuxième tache nous avons identifié par une approche globale des éléments des ARNm qui réduisent l’efficacité de traduction. Nous allons les utiliser pour créer une librairie de gènes rapporteurs, qui devrai nous permettre d’identifier de nouveaux facteurs de traduction.

Perspectives

Ce projet vise à caractériser la fonction au niveau moléculaire de nouveaux facteurs de traduction. Nous proposons d’utiliser une approche multidisciplinaire afin de déterminer la fonction mais aussi la structure en complexe avec le ribosome de certains de ces facteurs. Notre étude récente sur la protéine EttA a été pionnière dans ce sens et a démontré l’efficacité d’une telle approche pour déterminer précisément la fonction et les mécanismes moléculaires impliqués dans le contrôle du ribosome.

La compréhension des mécanismes d’action, au niveau moléculaire, des protéines ABC-F sur le ribosome chez E. coli va créer les bases pour concevoir l’étude des protéines ABC-F humains. En effet, l’utilisation d’E. coli permet de mettre en place des criblages à grande échelle. Par ailleurs, nous avons déjà démontré que les outils techniques que nous avons développés au cours de notre étude sur EttA peuvent être utilisés pour explorer les fonctions des protéines ABC-F humains. Ceux-ci ont d’importantes implications pour la santé humaine, principalement dans la réponse immunitaire dirigée contre des ADN et ARN étrangers et le développement de cancers.

L’étude des protéines ABC-F impliqués dans la résistance aux antibiotiques chez des bactéries pathogènes permettra de comprendre le mécanisme par lequel la protéine ABC-F rend le ribosome tolérant à l’antibiotique. Ces informations devraient ouvrir des pistes pour le développement de nouveaux antibiotiques.

Le crible développé dans la deuxième partie du projet est un outil génétique qui peut être utilisé pour d’autres projets et doit permettre d’accélérer la découverte des fonctions de nouveaux facteurs de traduction. A plus long terme nous pensons pouvoir identifier des facteurs qui permettront d’améliorer les techniques de synthèses des protéines.

Productions scientifiques et brevets

Boël, G., Letso R. Neely H., Price W. N., Wong K.-H., Su, M., Luff, J., Valecha, M., Everett, J., Acton, T, Xiao, R., Montelione, G. T., Aalberts, D. P. & Hunt, J. F. (2016) Codon influence on protein expression in E. coli correlates with mRNA level. Nature 529, 358-363

Partenaires

CNRS FRE3630 Expression Génétique Microbienne

Aide de l'ANR 380 000 euros
Début et durée du projet scientifique décembre 2014 - 36 mois

Résumé de soumission

L’étude du ribosome et de la traduction des protéines a débuté dans les années 60. Les facteurs essentiels permettant de reproduire, in vitro, la traduction, ont depuis été identifiés. De plus, les révolutions techniques de la biologie structurale (cristallographie a rayon X et cryo-électromicroscopie) nous permettent, depuis le début des années 2000, d’avoir une vision précise des mécanismes moléculaires de la synthèse des protéines par le ribosome. Néanmoins, même si nous comprenons mieux les grandes étapes de la traduction et pouvons la récapituler in vitro dans des conditions très spécifiques, différentes des conditions cellulaires, les mécanismes de régulation de la traduction in vivo restent pour la plupart a découvrir.

Par exemple, la fonction du facteur de traduction Ef-P, identifié il y a 35 ans, a été caractérisée récemment. Ce facteur est nécessaire pour la traduction de séquences contenant des répétitions de proline (Ude et al., Science 2013 ; Doerfel et al., Science 2013). D’autres publications ont présenté la structure et la fonction de facteurs requis pour réguler et réserver les ribosomes durant la phase stationnaire de croissance d’Escherichia coli. (Boël et al., NSMB 2014 ; Polikanov et al., Science 2012). Ces travaux et d’autres montrent que nous n’avons pas encore identifié tous les partenaires intervenant dans la traduction. De plus, de nombreux facteurs sont connus pour interagir avec le ribosome mais leur fonction précise reste inconnue. J’ai répertorié une 80 de ces facteurs chez E. coli ce qui témoigne de l’étendue des zones d’ombre de la traduction. Ce projet de recherche propose d’élucider la fonction d’une partie de ces facteurs. Il est divisé en deux tâches. La première est l’étude des facteurs de traduction appartenant á la famille des protéines ABC-F, la seconde est la caractérisation de nouveaux facteurs de traduction par crible génétique.

La tâche 1, consiste à étendre et approfondir l’étude des facteurs de traduction de la famille ABC-F que mes collaborateurs et moi-même avons récemment caractérisés. La biosynthèse des protéines utilise plus de la moitié de l’énergie cellulaire, il est donc crucial pour la cellule de gérer ce processus le plus efficacement possible. Nous avons montré que la protéine EttA appartenant à la famille ABC-F module la dynamique du ribosome afin de réguler l’activité de synthèse des protéines en fonction du niveau d’énergie cellulaire. Nous avons caractérisé la fonction d’EttA sur le ribosome aux niveaux structurel, biochimique et physiologique. Je propose maintenant d’approfondir la caractérisation de la fonction d’EttA au niveau cellulaire, non seulement en déterminant si EttA agit spécifiquement sur certains ARNm, mais aussi en étudiant son implication dans le couplage entre la transcription et la traduction, comme des résultats préliminaires le suggèrent. Je propose en parallèle de caractériser la fonction des 3 paralogues d’EttA présents chez E. coli, ainsi que des orthologues responsables de résistance aux antibiotiques chez des bactéries pathogènes.

La deuxième tâche est le développement d’une méthode de criblage permettant d’identifier des phénotypes spécifiques de défaut de la traduction dans une collection de mutants. Cette collection sera composée de mutants de délétion de gènes dont le produit est connu pour interagir avec le ribosome mais dont la fonction reste élusive. Parallèlement nous mettrons en place une approche par « pull-down » afin d’identifier de nouveaux facteurs qui fixent le ribosome lorsque ce dernier cale sur des éléments qui ralentissent sa progression. Ces éléments seront des structures de l’ARN ou des répétitions de certains codons.

L’ensemble de se projet vise à l’installation, à long terme en France, d’une équipe dédiée a l’investigation de la fonction de nouveaux facteurs de traduction. Une partie de ce projet sera effectuée en collaboration avec mes collègues américains avec qui nous avons travaillé sur EttA.

 

Programme ANR : Accueil de Chercheurs de Haut Niveau (@RAction) 2014

Référence projet : ANR-14-ACHN-0027

Coordinateur du projet :
Monsieur Boel Gregory (Expression Génétique Microbienne)

Site internet du projet : http://www.ibpc.fr/UMR8261/equipeBoel/HomeBoel.htm

 

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L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.