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Blanc - SVSE 2 - Biologie cellulaire et biologie du développement (Blanc SVSE 2)
Edition 2013


OOCAMP


La régulation des divisions méiotiques de l’ovocyte : une approche in vivo du paradoxe des signalisations AMPc

Méduse et Xénope pour résoudre le paradoxe de l'AMPc des cellules reproductrices femelles
Comprendre comment au cours de l'évolution, une petite molécule, l'AMPc, a été utilisée de manière opposée par certaines espèces pour produire les cellules reproductrices femelles, les ovocytes.

Comprendre les mécanismes permettant la réalisation d'un gamète femelle apte à la fécondation.
Les cellules se reproduisent grâce au cycle cellulaire, un processus qui assure la croissance et le développement des êtres vivants. C’est l’activation du MPF (M-phase Promoting Factor, ou complexe Cdk1-cycline B) qui déclenche la division cellulaire. Un manque criant de connaissances règne sur certaines étapes cruciales du cycle, en particulier l'entrée en phase de division. OOCAMP a pour objectif d’améliorer nos connaissances de cette étape par une approche physiologique basée sur l’utilisation des ovocytes d’un amphibien, le xénope, et d’un cnidaire, la méduse Clytia : deux modèles simples et puissants, caractérisés par des arrêts naturels dans le cycle cellulaire, débloqués par des stimuli externes .
Lors de l’ovogenèse, les ovocytes entament la méiose et s’arrêtent en prophase de 1ère division méiotique, juste avant la division. Des signaux extracellulaires provoquent la reprise de la méiose en lançant des voies de transduction qui convergent vers l’activation du MPF. L’AMPc est le 1er effecteur impliqué en amont de ces voies, mais de manière surprenante il agit de manière opposée selon les espèces. Chez les vertébrés, la concentration en AMPc, et donc l’activité de la kinase PKA, sont maintenus à de hauts niveaux dans l’ovocyte bloqué en prophase, et doivent chuter pour permettre la reprise de la division méiotique. Au contraire, chez de nombreux invertébrés, comme Clytia, une augmentation d’AMPc et de l’activité PKA est requise pour permettre la sortie de l’arrêt en prophase. Nous avons pour objectif de comprendre la régulation exercée par l’AMPc en comparant et en interchangeant les régulateurs et les effecteurs du système AMPc dans nos deux modèles expérimentaux, le xénope et Clytia, chez lesquels l’AMPc joue un rôle opposé. Nous répondrons spécifiquement à deux questions : la nature du système moléculaire recevant le signal externe en amont de l’AMPc, et l’identification des substrats de PKA qui provoquent l’activation du MPF en aval de l’AMPc.

Associer l'imagerie, l'étude de l'expression des gènes et les fonctions des protéines
Notre approche repose sur des manipulations de biochimie et biologie moléculaire, couplées à des microinjections de protéines dans les ovocytes des deux espèces et au suivi des réponses physiologiques et moléculaires par microscopie et tests biochimiques. Nous combinons donc des approches d'imagerie cellulaire et de biologie moléculaire. Nous nous focaliserons sur une protéine appelée ARPP19, dont nos données chez le xénope indiquent qu’elle correspond au substrat critique de PKA responsable de l’arrêt en prophase des ovocytes de vertébrés. Une phosphorylation distincte d’ARPP19, catalysée par la kinase Greatwall (Gwl) transforme ARPP19 en un activateur du MPF, essentiel à l’entrée en division. Nous avons identifié l’homologue d’ARPP19 chez Clytia, qui possède les sites de phosphorylation par PKA et Gwl. Nous comparerons les fonctions des deux versions d’ARPP19. En parallèle, nous identifierons le récepteur du peptide qui est responsable de la reprise de la méiose chez Clytia par une nouvelle approche transcriptomique.

Résultats

Chez les animaux, les cellules reproductrices femelles (ovocytes) ne se divisent pas pendant de très longues périodes (mois ou années) dans les ovaires. Si leurs cycles de division ne s’arrêtent pas, les conséquences peuvent être désastreuses: par exemple les ovocytes peuvent être trop petits et défectueux ; ils peuvent commencer leur développement en embryon sans fécondation et donner une descendance anormale ou non-viable ; enfin, le potentiel reproducteur de l'ovaire peut s'épuiser rapidement. Chez les vertébrés, des chercheurs ont identifié une petite molécule très importante pour l’arrêt des divisions, l’AMP cyclique, qui active une enzyme particulière à l’intérieur des cellules, la protéine kinase A (PKA). Depuis cette découverte au début des années 70, personne n'avait compris comment PKA cause l’arrêt des divisions. Nos travaux révèlent enfin l’identité du maillon manquant : il s'agit de la protéine ARPP19.
Depuis 1990, ARPP19 était connue pour être la cible de PKA dans divers types cellulaires. Vingt ans après, un deuxième rôle pour ARPP19 a été découvert: sous l’influence d’une autre enzyme, Greatwall, ARPP19 stimule les divisions cellulaires. Nous chercherons à mieux comprendre ce double rôle d'ARPP19 dans les ovocytes. D’abord, en réponse au signal hormonal de l'ovulation, elle autorise la levée du blocage sous l’influence de la PKA. Ensuite, sous l’influence de Greatwall elle stimule les divisions méiotiques. D'inhibiteur de la division elle est donc convertie en un activateur essentiel l'ovocyte : le yin et le yang de la méiose. Nos études parallèles de l’ovocyte d’une grenouille et d’une méduse nous permettent de conclure que le rôle stimulateur d’ARPP est très ancien dans l’évolution animale, tandis que sa régulation par AMP cyclique est apparue uniquement chez les vertébrés.

Perspectives

Le projet OOCAMP vise à comprendre les systèmes biochimiques qui connectent les signaux extracellulaires de maturation méiotique et l’activation du MPF. L’étude de ce processus physiologique continuera à enrichir les connaissances de la régulation hormonale de la reproduction, du cycle cellulaire, des voies de signalisation et des mécanismes de l’oncogenèse. Outre les impacts d'ordre cognitif, nos travaux ouvrent aussi des perspectives d'ordre biomédical : futures voies de recherche ou de diagnostic à explorer chez les mammifères, et notamment l'espèce humaine.

Productions scientifiques et brevets

Dupre, A., Daldello, E.M., Nairn, A.C., Jessus, C., et Haccard, O., (2014). «Phosphorylation of ARPP19 by protein kinase A prevents meiosis resumption in Xenopus oocytes«. Nature communications, 2041-1723 (Electronic)
2041-1723 (Linking), 5, 3318.
Cet article résout un mystère vieux de près de 40 ans: l'identité de la protéine cible de l'AMPc qui contrôle la division de l'ovocyte.

Dupre, A., Buffin, E., Roustan, C., Nairn, A.C., Jessus, C., et Haccard, O., (2013). «The phosphorylation of ARPP19 by Greatwall renders the auto-amplification of MPF independently of PKA in Xenopus oocytes«. Journal of Cell Science, 1477-9137 (Electronic)
0021-9533 (Linking), 126, 3916-3926.
Cet article montre que les divisions particulières de l'ovocyte utilisent certaines des molécules de la division habituelle des cellules, mais d'une manière originale.

Partenaires

LBDV - partner 2 Biologie du Développement - UMR7009

LBD - UMR7622 Laboratoire de Biologie du Développement

Aide de l'ANR 311 376 euros
Début et durée du projet scientifique décembre 2013 - 42 mois

Résumé de soumission

Les cellules se reproduisent grâce au cycle cellulaire, un processus qui assure la croissance et le développement des êtres vivants. C’est l’activation du MPF (M-phase Promoting Factor, ou complexe Cdk1-cycline B) qui déclenche la division cellulaire. La connaissance des mécanismes de contrôle du cycle cellulaire est essentielle et a fasciné les biologistes depuis longtemps. Curieusement, malgré l’intérêt majeur suscité par ce processus, un manque criant de connaissances règne sur certaines étapes cruciales du cycle, en particulier le contrôle de la transition G2-M. Le projet OOCAMP a pour objectif d’améliorer nos connaissances de la transition G2-M par une approche physiologique basée sur l’utilisation des ovocytes d’un amphibien, le xénope, et d’un cnidaire, la méduse Clytia : deux modèles expérimentaux simples et puissants, caractérisés par des arrêts naturels dans le cycle cellulaire, débloqués par des stimuli externes définis capables d’induire la reprise du cycle cellulaire.
Lors de l’ovogenèse, les ovocytes entament la méiose et s’arrêtent en prophase de 1ère division méiotique (équivalent à une phase G2). Des signaux extracellulaires provoquent la reprise de la méiose en lançant des voies de transduction qui convergent vers l’activation du MPF. L’AMPc est le 1er effecteur impliqué en amont de ces voies, mais de manière surprenante il agit de manière opposée selon les espèces. Chez les vertébrés, la concentration en AMPc, et donc l’activité de la kinase PKA, sont maintenus à de hauts niveaux dans l’ovocyte bloqué en prophase, et doivent chuter pour permettre la reprise de la division méiotique (une situation analogue à celle du contrôle exercé par l’AMPc sur la transition G2-M du cycle mitotique). Au contraire, chez de nombreux invertébrés, comme Clytia, une augmentation d’AMPc et de l’activité PKA est requise pour permettre la sortie de l’arrêt en prophase. Nous avons pour objectif de comprendre la régulation exercée par l’AMPc en comparant et en interchangeant les régulateurs et les effecteurs du système AMPc dans deux modèles expérimentaux, le xénope et Clytia, chez lesquels l’AMPc joue un rôle opposé. Nous répondrons spécifiquement à deux questions : la nature du système moléculaire recevant le signal externe en amont de l’AMPc, et l’identification des substrats de PKA qui provoquent l’activation du MPF en aval de l’AMPc.
Notre approche repose sur des manipulations de biochimie et biologie moléculaire, couplées à des microinjections de protéines dans les ovocytes des deux espèces et au suivi des réponses physiologiques et moléculaires par microscopie et tests biochimiques. Nous nous focaliserons sur une protéine appelée ARPP19, dont nos données préliminaires chez le xénope indiquent qu’elle correspond au substrat critique de PKA responsable de l’arrêt en prophase des ovocytes de vertébrés. Une phosphorylation distincte d’ARPP19, catalysée par la kinase Greatwall (Gwl) transforme ARPP19 en un activateur du MPF, essentiel à l’entrée en division. Nous avons identifié l’homologue d’ARPP19 chez Clytia, qui possède les sites de phosphorylation par PKA et Gwl. Nous comparerons les fonctions des deux versions d’ARPP19. En parallèle, nous identifierons le récepteur du peptide qui est responsable de la reprise de la méiose chez Clytia par une nouvelle approche transcriptomique.
Les deux partenaires du projet OOCAMP, experts dans l’étude de la maturation méiotique, présentent une excellente complémentarité, à la fois sur le plan de leurs modèles animaux, de leurs approches techniques et de leurs expertises, ce qui assure la faisabilité du projet.
En conclusion, le projet OOCAMP vise à comprendre les systèmes biochimiques qui connectent les signaux extracellulaires de maturation méiotique et l’activation du MPF. L’étude de ce processus physiologique continuera à enrichir les connaissances de la régulation hormonale de la reproduction, du cycle cellulaire, des voies de signalisation et des mécanismes de l’oncogenèse.

 

Programme ANR : Blanc - SVSE 2 - Biologie cellulaire et biologie du développement (Blanc SVSE 2) 2013

Référence projet : ANR-13-BSV2-0008

Coordinateur du projet :
Madame Catherine JESSUS (Laboratoire de Biologie du Développement)

Site internet du projet : http://www.ibps.upmc.fr/fr/Recherche/umr-biologie-developpement/biologie-ovocyte

 

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